谢雨礼博士 | 药物创新：Close Is Everything

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生物其实就是一种通过生物分子之间的相互作用和化学反应进行能量和信息交换的体系。而且，分子的相互作用往往也是为了启动，加速或者抑制某些化学反应。因此，生物学的调控最终就是对化学反应的控制。

化学反应是分子之间的有效碰撞，导致化学键的断裂和新键的生成。分子的有效碰撞必须满足两个条件：一是分子的能量必须达到某一临界值，一般与体系的温度有关，大多数情况下温度越高反应就越快；二是分子的碰撞必须按照一定的方向靠近。浓度决定单位体积中分子的数量，浓度越高，分子间的距离越短，发生正确方向碰撞的机率越高，反应也就越快。

包括人类在内的许多生物是一个恒温体系，以适应外界环境不可控的温度变化。这样，浓度成为生物分子化学反应中最重要的可变因素。换句话说，生物体系可以通过改变生物分子的浓度实现精准调控。一个最好的例子就是近年来兴起的相分离或者生物分子凝聚体的概念。

生物分子凝聚体被《科学》杂志评为2018年十大科学突破，是指一种在细胞内通过类似于油水分离的相变过程形成的、没有膜结构的小液滴。这样的小液滴可以看作是蛋白和核酸等生物分子发生化学反应的一个临时反应器，它们既可以局部提高生物分子的浓度，促进化学反应和信号传递，也可以将有些分子隔离在外从而抑制某些化学反应和信号。生物分子凝聚体几乎参与到生命活动的各个环节，其调控作用的本质就是通过改变有关生物分子的局部浓度来实现的。

最近的研究发现生物分子凝聚体与肿瘤、中枢神经系统，自身免疫和感染等疾病高度相关，逐渐成为药物开发的前沿方向。2019年底，第一家基于生物分子凝聚体的生物科技公司Dewpoint成立。随后，Vivid 、Transition Bio、Nereid和Faze等欧美初创公司也纷纷获得大额风险投资。国内公开报道的公司包括奕拓医药和美度莎等。生物分子凝聚体给药物发现带来前所未有的视角。比如， Dewpoint公司发现药物在凝聚体中的分布影响药效的发挥。肿瘤细胞甚至可以通过增加凝聚体的体积来降低药物的相对浓度，使得同样剂量下的药物不再敏感，从而产生耐药（1）。筛选在凝聚体富集的药物可能成为开发新型抗肿瘤药物的一种手段。

值得注意的是，生物或者其基本单元细胞，并不是一个自由扩散的均匀体系。这就引申出一个 “有效浓度”的概念。反应中心附近的局部浓度越高或者反应分子的空间取向越有利，其有效浓度就越高。比如，在酶催化的反应中，底物分子与酶结合，使底物以有利的方向靠近酶的活性中心，因此反应中心局部的有效浓度大大增加，从而指数级地加速化学反应。这种现象被称作为酶的邻近效应。

通过改变生物分子之间的空间距离和取向影响生物分子的有效浓度和反应速率，是贯穿整个生物学调控的普遍规律。其实，前面提到的凝聚体的浓缩或者隔离效应也是一种邻近效应，常见的邻近调控还包括蛋白相互作用及其介导的信号传递、细胞膜的定位效应、生物分子的转位、核酸的碱基配对等。

以下用一个经典的信号传导作为例子来说明这一点。细胞与外界进行交流的一个重要途径是通过膜信号的转导。比如，生长因子（EGF和FGF等）与跨膜的受体结合，激活其细胞内酪氨酸激酶的活性并磷酸化自身或者其他底物蛋白的酪氨酸残基。这样，细胞外的信号被受体感知并在细胞内转化成磷酸化酪氨酸的化学形式。磷酸化的酪氨酸残基能够与含有SH2结构域的蛋白特异性的结合，由此将该类蛋白招募至酪氨酸磷酸化位点。这一邻近效应又触发一系列酶催化的联级反应，最终导致细胞分裂和增殖。可以看出，酪氨酸磷酸化介导的邻近效应是细胞生长信号传导的关键模块。肿瘤细胞非常聪明地利用了这一点。酪氨酸激酶是常见的癌症驱动基因，其自激活的突变导致细胞不受控制地快速分裂和增殖。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）也就是我们熟知的小分子肿瘤靶向药物。

RAS信号通路的调控则更加直观地展示了邻近效应的作用。RAS是一种GTP水解酶，与GTP结合时处于激活状态，能够快速启动下游的信号通路。当GTP被水解成GDP时，RAS蛋白就转变为关闭状态。因此，GTP的水解反应是调控RAS信号通路的关键步骤。RAS自身的水解反应其实很慢，但与GAP蛋白结合后，GAP将一个碱性的精氨酸残基伸到催化位点，加速水解，从而快速淬灭RAS活性，这个残基被称作精氨酸手指（arginine finger）。

不幸的是，精氨酸手指的邻近效应也被肿瘤细胞捕捉到并加以利用。事实上，RAS被称作癌基因之王，有超过30%的恶性肿瘤中发现RAS突变，其中KRAS这个亚型占到85%以上。RAS最常见的突变位点是G12和G13两个甘氨酸的突变。结构生物学研究表明，这两个甘氨酸如果替换成其他体积稍大的氨基酸，立体位阻将阻碍GAP的精氨酸手指靠近GTP水解位点，RAS蛋白就会长期处于激活状态，最终导致细胞的无限分裂和增殖。

从生物学和市场潜力来看，RAS，特别是KRAS应该是抗肿瘤药物的完美靶点。然而，长期以来RAS被认为是不可成药的靶点，原因是RAS蛋白没有可以供小分子药物竞争或者结合的口袋。目前，只有针对其中一个突变KRAS G12C，人们用小分子共价抑制剂很巧妙地解决了这个问题。这个突变蛋白中G12位的甘氨酸替换成了半胱氨酸（Cys），从而提供了一个可以与药物发生迈克尔加成反应的巯基。Shokat等人发现G12C被小分子药物共价修饰后，诱导出一个与药物结合的口袋，KRAS蛋白被锁在了非活性构象（2）。安进公司基于这一发现开发的AMG-510用于KRAS G12C突变的非小细胞肺癌已经获批上市，被认为是近年来小分子抗癌药物的重大突破。

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药物简单来说就是干预人体生物调控的一种手段。近年来，模拟和利用生物分子的邻近效应成为药物技术发展的新趋势。比如，上述攻克KRAS不可成药性的小分子共价技术就是模拟了酶催化的邻近效应。我们首先让药物分子带有一个中等反应活性的基团，比如丙烯酰胺。这个基团能够与带巯基的半胱氨酸发生迈克尔加成反应，但体内条件下反应速度很慢，甚至完全不反应。然而，一旦药物与靶点特异性结合，药物分子中的丙烯酰胺以合理的取向靠近靶点蛋白中的半胱氨酸残基，局部有效浓度剧增，加成反应瞬间发生，完成对靶点的不可逆抑制。对于KRAS G12C蛋白，在半胱氨酸残基（G12C）的旁边还要一个具有催化作用的赖氨酸（K10），协同加速迈克尔加成反应，共价分子的特异性得到进一步提高。这是AMG-510等KRAS抑制剂具有良好安全性的内在原因之一。

最近特别热门的分子胶和PROTAC等双功能分子其实就是邻近效应的具体应用。这些药物能够将两种蛋白质拉在一起并通过邻近效应触发化学反应和生物学信号。比如，当其中一个蛋白为泛素连接酶时，分子胶或者PROTAC可以引起靶点蛋白发生泛素化修饰，并通过蛋白酶体途径发生降解。自然界中，植物生长素即吲哚乙酸就是通过这一原理降解基因抑制蛋白的一种分子胶。研究发现，抗癌药物来那多胺和indisulam等也有类似的作用机制。相对于天然的或者意外发现的分子胶，PROTAC一般是理性设计的、分子量较大的分子，其结构包含三部分，一头是泛素连接酶的配体，另一头是靶点蛋白的配体，中间是连接子（linker）。Arvinas，Nurix和Kymera等公司靶向AR/ER、BTK和IRAK4等靶点的PROTAC最近纷纷获得初步的临床数据。

通过切换不同的酶和靶点，双功能分子还能通过各种途径降解蛋白，RNA/DNA，细胞亚结构甚至细胞本身。类似地，如果招募去磷酸化酶，还能实现对目标蛋白的去磷酸化。耶鲁大学的David A. Spiegel实验室设计了一类可以招募人体自身抗体的双功能分子，具有调节免疫和抗感染的潜力（Kleo Pharm）。当然，双功能分子将两个蛋白拉在一起，不一定要发生化学反应，也可以形成稳定的三元复合物结构，从而更加有效地抑制靶蛋白的功能。比如，Revolution开发的、通过招募内源蛋白cyclophilin抑制KRAS G12C和G12D的分子胶药物，最近有令人印象深刻的临床前数据发表。

邻近性原理在大分子药物中也有广泛应用。经典的双抗其实就是一种“细胞胶”技术，或者叫做细胞接合器（cell engager）。比如，基因泰克的BiTE双抗一头结合肿瘤细胞的抗原CD19，另一头结合T细胞的受体CD3，将肿瘤细胞和T细胞拉在一起，让T细胞就近杀死肿瘤细胞。另外，单抗介导的ADCC和CDC等细胞毒性，本质上也是一种“细胞胶”效应，在抗肿瘤药物的设计中日益受到重视。

其实也可以将识别肿瘤抗原的抗体直接组装到免疫细胞中，让免疫细胞能够特异性与肿瘤细胞结合，通过邻近效应触发免疫反应。这就是我们熟悉的细胞疗法，也是生物医药技术创新的前沿领域，比如CAR-T、CAR-NK、CAR-M以及TCR-T等。

药物技术沿着生命“中心法则”历经百年，由外及里全面覆盖了蛋白质，核酸和基因三个环节。这几年，在GalNac和LNP等递送技术的推动下，反义核酸和siRNA等小核酸药物重新崛起。新冠疫情以来，mRNA技术、基因疗法和基因编辑等新技术也获得了飞速发展。这些技术都是基于核酸的碱基配对原理，药物设计方便快速，因此被誉为可编程药物（Programmable Medicine）。

从化学上理解，碱基配对就是碱基(A对T或C对G)通过氢键作用形成碱基对。互补的碱基系列可以形成DNA双螺旋这样的双链结构。核酸分子通过碱基的氢键作用，按照确定的方式相互靠近、折叠和结合，可能是大自然最精妙的设计之一。事实上，DNA双螺旋结构的发现被认为是现代生物医药技术的起点。

不难想象，碱基配对介导的邻近效应在核酸相关的生物调控和药物设计中得到了普遍应用。

比如，2006年获诺奖的siRNA某种程度上类似于上面提到的分子胶。siRNA的引导链在Dicer酶的帮助下与沉默复合物（RISC）结合，然而通过碱基互补招募对应的mRNA，邻近效应触发RISC复合物中的Argonaute蛋白对mRNA实施切割。

2020年获诺奖的CRSPR-Cas9基因编辑技术来自细菌，作用机理与siRNA相似，本质上也是邻近性原理的应用。在这里，sgRNA充当一种分子胶，把目标DNA与具有DNA切割能力的Cas9蛋白定位于一起，获得了一种高效可控的切割DNA的强大工具。人们还开发了Cas13等不同的Cas蛋白，将编辑技术扩展至RNA分子。

Cas9蛋白通过突变（dCas9）可以去掉其DNA切割的活性但仍保留与sgRNA特异性结合的能力（3）。2016年，哈佛大学刘如谦实验室在此基础上开发了单碱基编辑工具。他们将dCas9与胞苷脱氨酶融合，在sgRNA 指导下不是切割基因而是纠正基因的单碱基突变，这一工具将基因编辑的应用范围进一步扩大，而且减少了DNA断裂导致的致癌风险（4，5）。

刘如谦的工作可能是基因编辑应用领域最重要的突破之一（5）。没有切割功能的dCas9这时相当于一种连接子（linker），通过蛋白融合可以招募其他具有不同生物活性的酶，为精确操控DNA和RNA分子提供了无限可能性。随后，刘如谦等人通过dCas9嫁接逆转录酶和DNA甲基化酶又开发了可以替换大段DNA的“Prime editing”技术（Prime Medicine），以及表观遗传编辑工具（Chroma和Omega）。

类似的原理也适用RNA单碱基编辑（5）。人们发现乌贼和章鱼能够利用一种称为ADAR的酶和指导RNA的定位对特定RNA序列进行单碱基编辑。与DNA编辑造成的永久变化不同，RNA编辑作用是暂时的，避免了长期风险。2017年，张锋团队将ADAR的催化部分与Cas13蛋白融合开发了更加高效的RNA单碱基编辑器。这些技术都获得了大额的风险投资，成为当下热门的赛道之一（Korro Bio，Beam、Shape 、ProQR 、Locana等）。

综上所述，邻近性原理对于我们理解生物调控和药物设计都具有重要的指导意义。我想刘如谦教授能够成为基因编辑领域的大牛，与他多年从事DNA模板反应的研究有很大的关系。DNA模板反应其实就是利用DNA双链互补的邻近效应，将DNA标记的化学分子拉近从而促进他们之间的化学反应。在总结普遍规律的基础上进行逻辑推演正是西方科学和创新的精髓，非常值得我们学习和领会。

参考文献

1. Isaac A Klein，et al. Partitioning of cancer therapeutics in nuclear condensates Science 2020 Jun 19;368(6497):1386-1392

2. Nature. 2013 Nov 28;503(7477):548-51

3. Lei S Qi ，et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 2013 Feb 28;152(5):1173-83

4. Alexis C Komor ，et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 2016 May 19;533(7603):420-4

5. 引自《生物医药技术评述》，谢雨礼

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